Изучение видового разнообразия микрофлоры зерна

В. Афонюшкин, Е. Храпов, О. Мишукова, Е. Дударева, М. Филипенко, Ю. Юшков, ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Лабораторный контроль партий корма и кормовых ингредиентов, как правило, ограничивается оценкой общей микробной обсеменённости с использованием питательных сред, позволяющих определить содержание узкого спектра микроорганизмов и ограниченного числа видов бактерий, преимущественно имеющих медикосанитарное значение.

Парадоксально, что микроорганизмы, способные накапливаться в кормах и обладающие патогенностью и/или токсичностью для животных и человека, не контролируются. К патогенным и токсигенным бактериям следует отнести P.aeruginosa, S.aureus, некоторые клостридии. Однако перечисленными видами список микроорганизмов, способных наносить ущерб, не следует ограничивать.

На поверхности зерна обитает разнообразная микрофлора. Часть микроорганизмов попадает из ризосферы, некоторые заносятся с пылью и насекомыми. На зерне, как и на всей поверхности растений, развиваются так называемые эпифиты, которые получили название микроорганизмов филлосферы. Эпифиты питаются продуктами экзосмоса растений. Микрофлора растений составляет неотъемлемую часть внешней среды, с которой те взаимодействуют, она — элемент естественной защиты растительного организма благодаря проявлению природной антагонистической активности по отношению к фитопатогенам. Ненормированное использование химических препаратов и внесение повышенных доз удобрений с целью увеличения урожая приводят к нарушению экологического равновесия и селекции резистентных форм возбудителей болезней сельскохозяйственных культур. В связи с этим возрастает значение эпифитовантагонистов, представляющих практический интерес для биологической защиты растений от болезней. Одним из основных источников эпифитной микрофлоры на поверхности растений являются семена. Состав этих микроорганизмов изучен недостаточно, особенно в связи с региональной спецификой. К примеру, среди обнаруженной эпифитной микрофлоры зерна яровой пшеницы доминируют бактерии, представленные следующими родами: Micrococcus, Pseudomonas, Baccilus, Mycobacterium, Streptococcus, Sarcina, Xanthomonas, Erwinia. Тем не менее следует учитывать, что вышеперечисленные микроорганизмы мажорные. В то же время некоторые представители эпифитной микрофлоры, не являющиеся мажорными видами, могут представлять опасность для здоровья человека и животных.

Цель нашего исследования — расширение знаний о спектре микроорганизмов в составе микробиоценозов зерна в Западной Сибири.

Для исследования использовали 20 проб пшеницы (Triticum vulgaris). Первичную изоляцию культур проводили на Eugonic агаре (Биомерье).

Выделение термофильных бактерий проводили при температуре 60°С, изучали наличие галотолерантных бактерий, культивируемых при этой же температуре, но с добавлением 5% NaCI. Проводили также поиск микроорганизмов, устойчивых к солям цинка, меди, йода, селена, марганца. Культуры тестировали на каталазную, цитохромоксидазную активности, образование нитритов, синтез пигментов, антибиотикорезистентность, изучали культуральные и морфологические свойства. Беттагалактозидазную, триптофандезаминазную и глюкоронидазную активности проверяли на среде Уриселект 4 (BioRad). ДНК выделяли фенолхлороформенным методом, вид определяли на основе секвенирования фрагмента гена 16S рибосомальной РНК и межгенного спейсера 16-23S рибосомальной РНК и совокупности биохимических, культуральных и морфологических признаков.

ПЦР проводили в конечном объёме 25 мкл, содержащем 67 мМ трис.-HCI (рН 8,9), 16 мМ сульфат аммония; 2,4 мМ MgCI2; 0,01% Твин 20; 0,2 тМ дНТФ; 0,3 ткМ растворы олигонуклеотидных праймеров и 1 ед. Taq-полимеразы; 27f 5'-AGAGTTTGATCCTGCCTCAG-3'; HDA-25'-GTATTACCGCGCCTGCTCCACA-3'.

Реакцию осуществляли 3 мин на амплификаторе типа «Терцик» (НПФ ДНК-Технология, Россия) с начальной денатурацией при 95° С, далее 10 с в течение 36 циклов с денатурацией при 95°С, отжигом 10 с при температуре 62-64°С и синтезом 15 с при 72°С. Финальная элонгация 3 мин проводится при 72°С, электрофорез — в 6% ПААГ. ПЦР-продукты использовали для секвенирования по Senger.

Наиболее часто встречающимся видом среди термофильных и галофильных микроорганизмов являлся Bacillus coagulans (табл. 1).

Таблица 1

Среди термофильных микроорганизмов часто выделяли Bacillus smithii. В процессе определения микроорганизмов, устойчивых к различным химическим соединениям, как правило, в каждой пробе при разных условиях выделяли один вид, или толерантных бактерий не обнаруживали. Например, при исследовании 20 проб пшеницы лишь из одной удалось выделить микроорганизм рода Bacillus. Представители микрофлоры, устойчивые к различным неорганическим соединениям, представлены в таблице 2
Таблица 2

Следует разделить микрофлору зерна на потенциально опасную и полезную для здоровья животных и человека. К опасным среди обнаруженных видов можно отнести: Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus cereus. Некоторые микроорганизмы не удалось идентифицировать даже с использованием метода секвенирования, это могут быть новые виды.

Stenotrophomonas maltophilia — грамотрицательные палочки длиной 0,5-1,5 мкм, облигатные аэробы. На плотных средах колонии гладкие, блестящие, с ровными краями и коричневатым или зеленоватым (на кровяном агаре) пигментом, лактозоотрицательные колонии на средах Эндо и Левина. По литературным данным, этот инфекционный агент является наиболее ярким примером возбудителя гнойно-септических заболеваний с природной множественной лекарственной устойчивостью. За последние 10-15 лет вид резко увеличил своё этиологическое значение при гнойно-септических инфекциях различной локализации. Спецификой его клинических штаммов является природная устойчивость к большинству современных антимикробных препаратов широкого спектра действия: пенициллинам, цефемам, карбапенемам, аминогликозидам, фторхинолонам. Несмотря на рост этиологического значения S. maltophilia при внебольничных и особенно при внутрибольничных инфекциях, этот вид возбудителей остаётся малоизвестным. Сведения о его значении и свойствах за последние 10-15 лет получены исключительно на штаммах, выделенных за рубежом. В российской научной литературе основные публикации, посвящённые выделению, идентификации и определению чувствительности клинических штаммов неферментирующихся бактерий, включая S. maltophilia (Pseudomonas maltophilia), относятся главным образом к 80-м годам прошлого века. Исключение составляет обзор М.Н. Зубкова, посвящённый группе этих бактерий, опубликованный в 2003 году. Род Stenotrophomonas включает 5 видов, из которых клинически значимым к настоящему времени считается только S.maltophilia, широко распространённый в окружающей среде (почва, вода, сточные воды, растения, продукты растительного и животного происхождения, больничная среда, включая источники воды, аппаратуру, инструментарий, дезинфицирующие растворы). Описано его присутствие в кишечнике у пациентов в стационаре, в носоглотке у здоровых лиц.

В.cereus — патогенный представитель рода Bacillus, в отличие от непатогенных бактерий этого рода, имеет крупные размеры, вызывает гемолиз на кровяном агаре, преимущественно факультативный анаэроб.

Он продуцирует несколько токсинов, включая некротизирующийся энтеротоксин, рвотный токсин, фосфолипазу С, протеазы, гемолизины и энтеротоксины, которые являются важными детерминантами вирулентности. Энтеротоксин и рвотный токсин ответственны за симптомы диареи и рвоты, имеющие место при гастроинтестинальных заболеваниях. Роль in vivo гемолизинов и фосфолипазы не совсем ясна, но они могут быть значимыми детерминантами вирулентности при раневой и инфекции глаза и др. Большинство штаммов являются каталаза-позитивными, обладают перитрихеально расположенными жгутиками и спорулируют в воздухе, что отличает представителей этого рода от клостридий. Мы отмечали несколько случаев массовых кормовых токсикоинфекций у свиней и сельскохозяйственной птицы. Как правило, на среде Китта-Тароци обнаруживали большое количество крупных грамположительных палочек, растущих также на агаре Мюллера-Хинтона и селективных средах (среда Мозеля) для В.cereus.

К одной из форм псевдомоноза мы относим кормовую токсикоинфекцию. При повышенной влажности кормов обнаружены высокие концентрации синегнойной палочки (СГП), более 1 млн. КОЕ/г. Ввиду того что она способна накапливаться в окружающей среде, то при высоких её концентрациях возможно заболевание бройлеров предубойного возраста. Как правило, мы отмечали наличие ассоциированной формы инфекции E.coli и СГП. Характерной особенностью при этом было воспаление прямой и двенадцатиперстной кишки, катаральное воспаление железистого желудка, у молодняка желудок приобретал тёмную окраску, гепатит, холецистит.

При потреблении лабораторными животными кормов с повышенной обсеменённостью СГП отмечалось уменьшение содержания лактобактерий в желудочно-кишечном тракте в несколько десятков раз. воспроизводились аналогичные поражения желудочно-кишечного тракта.

Бактериологическая диагностика псевдомоноза была затруднена из-за ассоциированного заражения кишечной палочкой, которая высевалась в большем количестве, чем СГП. В данной ситуации обязательно использование селективной среды для выделения P.aerugenosa с цетримидом или ПЦР

Обобщая результаты исследований, можно утверждать следующее: в ветеринарии и гуманитарной санитарии недооценена роль Pseudomonas aeruginosa в качестве источника кормовых токсикоинфекций сельскохозяйственной птицы и животных и ассоциированных инфекций типа эшерехиоз- псевдомоноз у цыплят-бройлеров предубойного возраста, что повышает риски заражения людей при потреблении продуктов птицеводства.

Список видов, обладающих потенциально полезными свойствами, более обширен: Bacillus- coagulans, Bacillus subtilis, Bacillus smithii, Paenibacillus dendritiformis, Lactococcus lactis.

B.coagulans — грамположительная палочка толщиной 0,9 мкм и длиной от 3 до 5 мкм. Это — факультативный анаэроб, каталазопозитивная подвижная бактерия, образует споры, может образовывать грамотрицательные формы при стационарной фазе роста. Температурный оптимум культивирования 50°С, диапазон для роста варьируется от 30-55° С.

По литературным данным, Bacillus coagulans — вид бактерий, относящийся к роду Bacillus, образует молочную кислоту. Микроорганизм был впервые изолирован и описан в 1932 году. Первоначально отнесён к спорообразующим лактобактериям. Сходство Bacillus coagulans по отдельным характеристикам и с родом Lactobacillus, и с Bacillus, его таксономическое положение между семействами Lactobacillaceae и Bacillaceae длительное время оставалось дискуссионным. Тем не менее в последней редакции Bergey's данный микроорганизм был окончательно отнесён к роду Bacillus. Анализ ДНК позволил выявить различия между двумя родами бактерий, имеющих немало общих морфологических, биохимических и физиологических характеристик.

Bacillus coagulans используется для ветеринарных целей в качестве биопрепарата. Ценность для пищевой промышленности и животноводства подтверждена такими организациями, как U.S. Food and Drug Administration's Center for Veterinary Medicine (США), AAFCO (Европа), и рекомендована для использования при производстве животноводческой продукции. В ветеринарии этот микроорганизм применяют в качестве пробиотика, особенно для свиней и овец. В гуманитарной медицине этих бактерий также используют для восстановления вагинальной микрофлоры, при различных патологиях желудочно-кишечного тракта, они способствуют активации иммунного ответа при вирусных инфекциях. Бактерии могут быть защитой различных пищевых ингредиентов. Споры активируются в кислой среде желудка, прорастают и пролиферируют в кишечнике.

Bacillus smithii рассматривается в качестве потенциального «агента исключения источников пищевых инфекций». Внесение спор данного микроорганизма в корм мышам одновременно с S.enteric снижало уровень инфицированнос ти сальмонеллой внутренних органов мышей.

Заключение. Микрофлора зерна характеризуется широким спектром микроорганизмов, способных влиять на здоровье животных и птицы как положительно, так и отрицательно. В условиях Западной Сибири целесообразно дополнительно контролировать в кормах содержание B.cereus, S.maltophili, P.aeruginosa, а для свиней следует количественно оценивать содержание S.aureus.

Статья была опубликована в журнале "Птицеводство" №10, 2010 год