Новые подходы к диагностике ассоциированных инфекций у кур

С. Федотов, М.Черных, Е. Капитонов, Алтайский ГАУ

Проблема диагностики ассоциированных инфекций в промышленном птицеводстве приобрела особую зна­чимость в связи с изменением формы инфекционной патологии и появлением экзотических заболеваний.

В последние годы наблюдается увеличение удельно­го веса инфекций, вызванных ассоциациями условно-патогенных микроорганизмов. Они характеризуются выраженным клиническим полиморфизмом, связан­ным с одновременным воздействием нескольких аген­тов, что затрудняет интерпретацию результатов лабора­торных исследований, так как каждая из составляю­щих микст-культур обладает рядом признаков, сочета­ние которых может определять патогенный потенциал возбудителей в целом.

Установлено, что такие заболевания препятствуют вы­явлению основного этиологического агента, вызываю­щего инфекционный процесс, и затрудняют проведе­ние этиотропной противоинфекционной терапии. Так­же не полностью расшифрована структура самих мик­робных ассоциаций, не в достаточной мере выявлена роль некоторых составляющих микроорганизмов в их прямом или опосредованном влиянии на организм птицы.

В то же время межбактериальные взаимодействия как один из механизмов формирования ассоциаций микроорганизмов и проявления их патогенных свойств изучены недостаточно в связи с несовершен­ством методов диагностики.

Проводя вскрытие больной птицы на яичных птице­фабриках («Молодёжная» Первомайского района и «Павловская» Павловского района), мы находили де­формированные фолликулы, содержимое которых было разжижено или уплотнено. В их оболочках отме­чали точечные кровоизлияния. Однако рядом с пато­логическими наблюдались и нормально сохранившие­ся фолликулы. Клиническое проявление фолликулита яичника у кур-несушек сопровождалось прекращени­ем яйценоскости.

Анализируя биохимические изменения в крови клинически больной птицы, данные патолого-анатомического вскрытия и результаты морфологических исследований, можно предположить, что характер патоморфологических изменений структуры фолли­кулов яичника указывает на выраженное цитотоксическое действие возбудителя инфекции. Наблюдает­ся усиление лимфоцитарной инфильтрации фолли­кулярной и текальной оболочек, увеличение количе­ства форменных элементов крови и тканевых базофилов.

У кур с патолого-анатомическими признаками фол­ликулита яичник был контаминирован стафилококками, кишечной палочкой, стрептококками и протеем во все сроки наблюдений. Максимальное число такой птицы установлено в период активной яйценоскости. Микрофлора преимущественно была в форме ассоци­аций, при этом в большей степени выделялись орга­низмы с высокой степенью вирулентности, такие, как золотистый стафилококк и гемолитические штаммы эшерихий.

Так, из фолликулов яичников кур в возрасте 150-250 дней стафилококки отмечены чаще, чем другие микро­организмы, — в 56 случаях (63,64%). В том числе с ки­шечной палочкой — в 14 (15,92%); с кишечной палоч­кой и стрептококком — в 8 (9,09%); со стрептококком — в 1 (1,14%); с протеем — в 7 (7,95%); с протеем и кишеч­ной палочкой — в 4 (4,55%) и в 22 (25,0%) — в виде мо­нокультур.

Высокой степенью высеваемости характеризовалась и кишечная палочка (42,05% случаев), особенно со ста­филококками (15,92% случаев). Число птицы, у кото­рой из содержимого фолликулов выделяли ассоциа­ции кишечной палочки со стрептококком, составило 3 (3,41%) головы. В 2 (2,27%) случаях она наблюдалась с протеем, в 8 (9,09%) — со стафилококками и стрепто­кокками, в 10(11,36%) — в виде монокультур.

В большинстве случаев стрептококки и протеи из со­держимого фолликулов в виде монокультур изолиро­вали только от трупного материала взрослых кур, а ста­филококки и кишечную палочку высевали как из тру­пов, так и вынужденно убитой птицы.

При микробиологической диагностике репродуктив­ных органов у клинически здоровых кур стафилокок­ки, энтерококки и др. не высевались. Фолликулы яич­ников были округлой формы различной величины. Их содержимое жёлтого цвета, и консистенция средней густоты.

Заболевания яичников у птицы имеют полимикроб­ную этиологию, ведущая роль в которой принадлежит условно-патогенным микроорганизмам, преимущест­венно в ассоциациях факультативно-анаэробной и анаэробной микрофлоры. Наши данные подтвержда­ются экспериментами Batra C.L., Singh В., Crewal C.S., SodhiS.S. (1982).

Микробиологические исследования показали, что на птицефабриках удаётся обнаружить распространение штаммов стафилококков следующих видов: St. aureus (72,7%), St. saprophyticus (13,6%) и St.epidermidis (13,6%). При проведении дальнейшей типизации St. aureus выявили различные биологические вариан­ты. Так, от кур с клиникой фолликулита яичника выде­ляли биовары hominis, gallinae и А/В. Кроме них на «Павловской» птицефабрике высеян биовар C/D, а на «Молодёжной» — canis. Тем не менее наблюдалась по­ложительная корреляционная связь между биологическими вариантами стафилококков вида St. aureus, выделенных на обеих птицефабриках (г=0,79).

В результате серологической типизации 78 энтеропатогенных культур 87% из них отнесены к сероварам: 01, 02, 078, 09, 055, OIII и OI4I. При этом к серотипу 02 мы отнесли 65,5% культур, к 078 — I 3,3, к 01 — 11,6%, к 09, OIII, OI4I — по одной культуре E.coli, к 055 — 2 куль­туры. Таким образом, наиболее распространенными и вирулентными для лабораторных животных были куль­туры эшерихий сероваров 01, 02, 078.

В процессе исследований выделено три группы стрептококков: b-гемолитические (Str. hemolyticus), вызывающие гемолиз эритроцитов; а-зеленящие (STR. viridans), образующие вокруг колоний зеленую зону гемометаморфоза; негемолитические у-стрептококки (Str. anhemolyticus), не изменяющие эритроциты и не вызывающие гемолиз кровяного агара. Из 32 культур стрептококков, выделенных в динамике заболевания кур, патогенными для белых мышей оказались 14, что составляет 39,64 процента.

Изучая морфологические и культурально-биохимические свойства бактерий из рода протея, выделен­ных из поражённых фолликулов, провели типизацию. Протея, разлагающего глюкозу (К+Г+) и сахарозу, от­несли к виду мирабильного (Proteus mirabilis), а раз­лагающего глюкозу (К+Г+), сахарозу и мальтозу — к вульгарному (Proteus vulgaris). Микробы этой группы характеризовались высокой степенью патогенности: 14 (57,33%) из 27 культур оказались патогенными для белых мышей.

Обобщая полученные результаты микробиологичес­ких исследований, отмечаем, что из поражённого яичника выделяли стафилококки, представленные St. aureus, St. saprophyticus и St. epidermidis и Е. coli в виде сероваров 01, 02, 078. Реже отмечены стрепто­кокки и Protei vulgaris.

Полученные результаты подтверждаются исследова­ниями Датского института болезней птиц (Bisgaard M., Dam A., 1981). Они выявили смешанную микрофлору из поражённых половых органов кур в 16 случаях (11%), в то время как неспецифический рост — в 3. Об­наружили 19 различных О-групп кишечной палочки, наиболее часто встречался серотип 02.

В январе-феврале прошлого года было исследовано 600 ослабленных цыплят кросса F-15 в возрасте 1-5 дней. В результате у 1 70 голов выделена Е. coli; у 1 30 — St. aureus и Е. coli; у 60 - St. aureus; у 60 — St. aureus, Citrobacter frendi и Е. coli; у 90 — Citrobacter frendi и E. coli.

При микробиологическом исследовании эмбрионов (1 проба — 5 эмбрионов в возрасте 21 дня) выявлено 1 7 проб Е. coli; 1 3 — St. aureus и Е. coli; 6 — St. aureus; 6 — St. aureus, Citrobacter frendi и Е. coli; 9 — Citrobacter frendi и Е. coli.

Традиционно применяемые таксономические мето­ды идентификации патогенных микроорганизмов на птицефабриках Алтайского края основаны на исполь­зовании различных хемотаксономических тестов, таких, как специфическая ферментативная активность, способность метаболизировать сахар или поддержи­вать рост на средах с селективными добавками.

Сложность стандартизации условий подобных тес­тов, а также естественная фенотипическая вариабель­ность, присущая многим микроорганизмам, могут быть причиной неправильной идентификации.

В значительной мере бактериологи продолжают за­висеть от морфологических и биохимических критери­ев при определении микроорганизмов, выделяемых из патологического материала и объектов окружаю­щей среды.

В некоторых случаях идентификация и классифика­ция патогенных микроорганизмов не отвечает запро­сам ветеринарной практики. Обусловлено это наличи­ем ряда обстоятельств; основные: неудовлетворитель­ная экспрессия фенотипических признаков, прежде всего факторов патогенности у бактерий в различных условиях их культивирования; существование некультивируемых бактерий; способность более чем 20 ви­дов патогенных бактерий переходить в состояние по­коя, характеризующееся резко сниженной метаболи­ческой активностью и временной потерей способности к размножению; наличие генетического механизма, осуществляющего постоянное изменение антигенных детерминант в организме-хозяине, что, с одной сторо­ны, помогает возбудителю выживать в макроорганиз­ме, уходя от воздействия иммунного ответа организма-хозяина, а с другой — приводит к неудачам лаборатор­ной диагностики при использовании сероиммунологических методов.

Следует признать, что в лабораторной практике так­же существуют естественные ограничения при исполь­зовании фенотипических методов оценки лекарствен­ной устойчивости возбудителей ассоциированных ин­фекций.

Дискодиффузный метод определения чувствитель­ности к противомикробным препаратам является до­минирующим в практической деятельности ветеринар­ных лабораторий Алтайского края.

Его основное достоинство — простота в исполнении и экономическая доступность. До настоящего времени он остаётся предпочтительным для большинства лабо­раторий.

Вместе с тем очевидны его недостатки: метод ис­пользуют при определении чувствительности к анти­биотикам ограниченного числа микроорганизмов; он непригоден, если микроб не образует на поверхнос­ти агаризированной питательной среды или гомоген­ный газон определённой плотности, или газон обра­зуется после 24-часовой инкубации бактерий, а гри­бов — после 48 часов.

Для реализации метода пригоден узкий круг пита­тельных сред, зачастую не предназначенных для рос­та требовательных микроорганизмов. Зона подав­ления роста микроба не всегда адекватна его истин­ной чувствительности к противомикробным сред­ствам и т.д.

Кроме того, результаты хемотаксономических тестов могут быть искажены в связи со снижени­ем активности антимикробных препаратов в про­цессе длительного культивирования микроорга­низмов, поэтому не являются основанием для оценки их чувствительности.

Из представленных примеров видно, что в ар­сенале современных бактериологических лабо­раторий птицефабрик должны быть методы, поз­воляющие идентифицировать, классифициро­вать и дифференцировать патогенные микроор­ганизмы независимо от формы или состояния.

Помимо традиционных способов определе­ния видовой принадлежности возбудителей ас­социированных инфекций должно уделяться внимание их геномным характеристикам. Это особенно важно для тех микроорганизмов, ко­торые претерпевают адаптивные изменения под воздействием неблагоприятных экологических факторов, антибактериальной терапии, при контакте с больной птицей и продуктами птице­водства.

Методы индикации микроорганизмов должны сочетать быстроту, специфичность, обладать функцией мультиплексности, соответствовать современному уровню развития лабораторного дела.

К таким сегодня относятся ПЦР и секвенирование чувствительности и специфичности, которые превосходят все существующие до настоящего времени хемотаксономические методы, посколь­ку выявляют гены (нуклеиновые кислоты) возбу­дителей, а не антигены и антитела.

Применение ПЦР-диагностики для выявления источника возникновения очага инфекции, выде­ление и изучение возбудителей инфекционных болезней (ассоциированных инфекций) как в те­чение эпизоотии, так и в межэпизоотический пе­риод позволит следить за изменением генетичес­кой структуры микроорганизмов, предсказывать появление новых вариантов и создавать адекват­ные средства защиты и диагностические препара­ты. Помимо этого она позволяет определять на­личие возбудителя в период так называемого «серологического окна», то есть в промежутке между моментом инфицирования организма и появлением антител в количествах, достаточных для определения.

Метод ПЦР обладает рядом преимуществ перед хемотаксономическими методами. К настоящему времени материальная база для его успешного применения достаточно развита. Все её компо­ненты (приборы, наборы для выделения ДНК, ферменты и т.д.) широко представлены на рынке и становятся доступными по цене. Внедрение его позволит более эффективно проводить лечение и профилактику заболеваний, вызванных ассо­циированными инфекциями.

Статья была опубликована в журнале «Птицеводство», 2010 год.