Инструкция по искусственному осеменению свиней
ОЦЕНКА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ

Для определения пригодности спермы к использованию в свежем или сохраненном виде сначала проводят общую санитарную оценку ее по цвету, запаху и консистенции. Сперма должна иметь белый цвет с сероватым оттенком, специфический запах, водянистую консистенцию. Сперму с примесью крови, гноя или мочи, а также со зловонным запахом использовать запрещается.
Сперму фильтруют через четыре слоя стерильной марли в стерильную теплую мензурку. Объем профильтрованной спермы измеряют в градуированной мензурке или t мерном цилиндре, подогретых до температуры спермы.
Для исследования спермы под микроскопом от общего объема берут 2-3 мл в стерильный флакон из-под антибиотиков. Микроскопическая оценка спермы проводится на определение подвижности, концентрации и выживаемости спермиев.
Стерильной пипеткой или стеклянной палочкой наносят на чистое сухое предметное стекло каплю спермы и накрывают ее покровным стеклом, переносят на предметный столик микроскопа, помещенный в специальный термостат с температурой 40-42°С, или на нагревательный столик, и оценивают сперму при увеличении микроскопа в 200-300 раз. В одной капле спермы под микроскопом одновременно определяют густоту и подвижность спермиев.
Густая сперма (условное обозначение Г) соответствует концентрации 200 млн. и больше спермиев в 1 мл - все поле зрения микроскопа густо заполнено спермиями.
Средняя сперма (условное обозначение С) соответствует концентрации от 100 до 200 млн. спермиев в 1 мл – заметны промежутки между спермиями.
Редкая сперма (условное обозначение Р) соответствует концентрации менее 100 млн. спермиев в 1 мл – заметны большие промежутки между спермиями.
Глазомерная оценка концентрации спермы по густоте расположения спермиев ориентировочна и по ней не может быть установлена степень разбавления спермы.
Подвижность спермиев определяют глазомерно по десятибалльной шкале. Каждый балл равен 10% спермиев, обладающих прямолинейно-поступательным движением. Если в поле зрения микроскопа таких спермиев 100%, такую сперму оценивают 10 баллами, 90%- девятью баллами и т.д. При содержании в сперме менее 10% поступательно подвижных спермиев, ее оценивают как с единичными поступательными движениями буквами ЕП Сперма с манежными и колебательными движениями спермиев балльной оценки не получает. Сперму только с колебательными движениями спермиев обозначают буквой К , мертвую сперму - буквой Н (некроспермия). Важный показатель качества спермы - концентрация спермиев в 1 мл. Определение концентрации спермы имеет важное значение для разбавления и дозирования спермы при осеменении маток. Концентрацию спермиев можно определять в счетной камере, фотоэлектроколориметром (ФЭК) или по оптическому стандарту.
Для определения концентрации спермиев в счетной камере Горяева необходимы смеситель с белым шариком (лейкоцитный) и стекла шлифованные. Подсчитывают спермин так. Над сеткой в средней части камеры плотно притирают покровное стекло (до появления радужных колец). Камера и стекло должны быть чистыми и совершенно сухими. В смеситель через резиновую трубочку насасывают сперму до отметки 0,5 , а затем 3%-ный раствор хлористого натрия до верхней части шейки с отметкой 11. Таким образом сперму разбавляют в 20 раз. Зажав концы смесителя между большим и указательным пальцами, встряхивают его в течение 2-3 мин. для равномерного перемешивания спермы с раствором. Затем из смесителя удаляют две капли (в них нет спермиев) - это содержимое капилляра, заполненного хлористым натрием, а третью каплю наносят на среднюю часть камеры у самого края притертого покровного стекла. Сперма проникает в щель под покровное стекло и заполняет пространство между сеткой и стеклом. Необходимо следить, чтобы на сетке камеры не образовывались пузырьки воздуха и сперма не вытекала за края покровного стекла.
Подсчитывают под микроскопом спермин по диагонали в пяти больших (80 малых) квадратах сетки. При подсчете принимают во внимание только головки спермиев, лежащие внутри квадрата. Головку считают лежащей внутри квадрата, если там находится три четверти ее размера. Если же головка пересечена пограничной линией квадрата пополам, две половинки считают за одного спермия. Подсчитанных в каждом большом квадрате спермиев записывают, данные подсчета соответствуют концентрации спермы в млн.мл. Например, в 80 малых квадратах насчитано 250 спермиев. Это соответствует концентрации спермы 250 млн.мл.
После работы смеситель, камеру, предметные и покровные стекла тщательно моют сначала простой, потом дистиллированной водой, а затем высушивают 96°-ным спиртом и эфиром.
Можно определять концентрацию спермы в счетной камере Горяева, но без меланжера. Для этого пипеткой набирают 9,5 мл 3%-ного раствора хлористого натрия и выливают в колбочку (25-50 мл), добавляют 0,5 мл спермы и тщательно смешивают. Каплю спермы, разбавленной в 20 раз, наносят на камеру стеклянной палочкой или глазной пипеткой. При этом способе можно разбавлять сперму в 40, 60 и 80 раз, что облегчает подсчет спермиев в камере.
Для подсчета концентрации спермиев в 1 мл спермы при разбавлении в 40 раз подсчитанное количество спермы умножают на 2 млн., в 60 раз - на 3 млн., в 80 раз - на 4 млн. Концентрацию спермиев подсчитывают по такому же принципу.
Концентрацию спермиев по оптическому стандарту определяют следующим образом. В прилагаемую к стандарту чистую пробирку (использование пробирок другого диаметра не допускается) наливают пипеткой 1 мл 1%-ного раствора хлористого натрия. Микропипеткой набирают 0,1 мл свежеполученной профильтрованной спермы. Край микропипетки, который погружался в сперму, вытирают снаружи чистой марлей и обязательно промывают в этом же растворе 1 -2 раза. Пробирку слегка встряхивают, держат ее рядом со стандартом, который предварительно должен быть хорошо взболтан, а сзади их вплотную прикладывают газетный или книжный текст. Пробирку со спермой и стандарт с вплотную приставленным текстом держат на уровне глаз против падающего света. К исследуемой сперме добавляют градуированной пипеткой 1%-ный раствор хлористого натрия в таком количестве, чтобы высота букв шрифта и оптическая плотность были одинаковы со стандартом (для более точной оценки желательно сравнение оптической плотности проводить на разных шрифтах). Каждый раз при добавлении раствора содержимое пробирки и стандарт встряхивают для получения равномерной взвеси.
После того, как оптические плотности исследуемой спермы и стандарта уравняются, проводят расчет по следующей формуле:
К=50*(n+0,1),
где: К - концентрация спермы в млн.мл;
n - объем добавленного 1%-ного раствора хлористого натрия в мл;
50 - коэффициент.
Стандарт соответствует оптической плотности спермы хряков с концентрацией спермиев 5 млн.мл.
Пример. Для выравнивания оптической плотности до стандарта к исследуемой сперме добавлено всего 4,5 мл раствора хлористого натрия (с учетом раствора, ранее налитого в пустую пробирку). К=50*(4,5+0,1)=50*4,6=230 мл. Следовательно, в 1 мл исследуемой цельной спермы содержится 230 млн. спермиев.
При определении степени разбавления спермы, концентрация которой определялась по одному из указанных способов, необходимо учитывать глазомерную оценку спермы на подвижность спермиев и в зависимости от балльной оценки делать перерасчет.
Пример. Концентрация спермы определялась в камере Горяева и составила 200 млн.мл, а подвижность спермиев оценка в восемь баллов. Фактическая концентрация спермы составит 160 млн.мл (200x8).
Выживаемость спермиев в часах определяют по оценке их подвижности до шести баллов включительно. Разбавленную сперму (10-20 мл) проверяют через каждые 24 часа. Хорошая сперма имеет оценку не ниже шести баллов через 72 часа (672) (табл. 4). Этот показатель записывают в племенную карточку хряка.
	  	  	  	  	  	  	 
Определение абсолютного показателя выживаемости спермиев вне организма - наиболее объективный метод оценки качества спермы животных. Для определения этого показателя сперму разбавляют в 2, 4, 8 раз. Необходимо иметь четыре стерильных флакона из-под пенициллина, в которые, кроме первого, пипеткой емкостью 5 мл наливают по 5 мл среды для разбавления спермы. В первый (пустой) и второй флаконы наливают по 5 мл спермы. В первом флаконе сперма служит контролем. Во втором флаконе сперму смешивают с разбавителем и 5 мл переносят в третий флакон. В нем сперму опять смешивают и 5 мл переносят в четвертый флакон, из которого после смешивания выливают 5 мл. После разбавления оценивают подвижность спермиев при температуре 40° С во флаконах с контрольной и разбавленной спермой. Оценивают сперму во всех флаконах ежедневно, желательно в одно и то же время до тех пор, пока спермин не погибнут во всех флаконах. Подвижность спермиев записывают в специальную таблицу (табл. 5).
Абсолютный показатель выживаемости спермиев вычисляют по формуле:
где: S - абсолютный показатель выживаемости спермиев;
Z - знак суммы;
а - подвижность в баллах;
t - показатель времени, вычисленный по формуле:
где: Т - часов от начала хранения спермы до данного определения;
Тn+1 - время последующего определения;
Tn-1 - время предыдущего определения.
Хорошая сперма хряка должна иметь абсолютный показатель выживаемости при разбавлении в 4-8 раз не ниже 700.
Оптимальную степень разбавления спермы определяют по наибольшему показателю абсолютной выживаемости спермиев. При этом учитывают, что в дозе должно содержаться не менее 4-5 млрд. подвижных спермиев. При определении оптимальной степени разбавления спермы одновременно учитывают качество среды. При оценке качества сохраненной спермы следует учитывать, что спермин медленно выходят из состояния анабиоза. Поэтому каплю спермы необходимо брать такую, чтобы за период исследования при температуре 40-42°C в течение 3-5 минут она не могла подсохнуть. Для этого сперму осторожно перемешивают и стерильной стеклянной палочкой или пипеткой наносят каплю на чистое предметное стекло. Для более объективной оценки добавляют каплю 2,8%-ного раствора цитрата натрия и накрывают покровным стеклом, помещают на столик микроскопа и определяют подвижность спермиев.

Сперму разбавляют для увеличения объема эякулята, а также для обеспечения переживаемости и сохранения высокой оплодотворяющей способности спермиев вне организма. Это позволяет более рационально использовать хряковпроизводителей, хранить и транспортировать их сперму.
Разбавляют сперму через 20-30 минут после получения и определения ее качества в лаборатории, заранее облученной бактерицидными лампами БУВ-30 или БУВ-60.
Допускается к разбавлению и хранению сперма хряка с концентрацией IOO млн.мл и выше, с подвижностью спермиев не менее 8 баллов.
Температура среды перед разбавлением должна быть одинаковой со спермой. Среду приливают к сперме небольшими порциями, осторожно и смешивают после каждой добавленной порции. После разбавления спермы определяют под микроскопом подвижность спермиев.
Сперму хряков разбавляют синтетическими средами (разбавление от 1:1 до 1:5 в зависимости от подвижности и концентрации спермиев) с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось не менее 50 млн. биологически полноценных спермиев согласно ориентировочной таблицу 6.


Примечание. Если концентрация спермиев более 300 млнЛмл, сперму разбавляют перед осеменением дополнительно до нужной концентрации.
Для разбавления спермы применяют синтетические среды, выпускаемые в виде сухих заготовок или приготовленные непосредственно перед применением. Компоненты, предназначенные для разбавления спермы, должны быть химически чистыми и храниться в герметической упаковке в сухом темном помещении при температуре не выше 5° С.
Для разбавления и хранения спермы хряков при плюсовой температуре в течение трех суток применяют глюкозо-хелато-цитратные среды, в состав которых входят специальные